Espectrometría:
Estas técnicas están basadas en la interacción de las radiaciones electromagnéticas en la materia. Se utilizan los patrones característicos de la absorbancia de radiación electromagnética (REM o patrones espectrales) para identificar los analitos de interés, ya que el comportamiento de estas sustancias biológicas con respecto a las REM depende del número de átomos de carbono que poseen.
La espectrofotometría se basa en mediciones con detectores de la REM que se transmite; por ello es necesario apuntar las características básicas de este tipo de radiación.
La luz es una forma visible de REM, se comporta como si tuviera campos magnéticos y eléctricos oscilando en planos perpendiculares entre sí. Está formada por paquetes de energía denominados fotones. En espectroscopia el término luz define la forma visible de la REM junto con la ultravioleta y la infrarroja.
La longitud de onda del espectro electromagnético es la distancia entre los máximos de ondas sucesivas. En el sistema internacional (SI) se mide en nanómetros (nm, 10"9 m). Otros términos empleados son número de onda, que es el recíproco a la longitud de onda, y la frecuencia, que es el número de ondas por segundo. La longitud de onda es inversamente proporcional a la energía: mientras mayor es la longitud de onda, menor es el número de fotones que contiene.
La REM está compuesta por varios tipos de radiación: rayos gamma, rayos X, rayos ultravioleta (UV), radiación visible (RV), radiación infrarroja (IR), microondas y ondas de radio (Tabla 1). En espectrofotometría de absorbancia se emplean las regiones UV (195-380 nm), RV (390-780 nm) e IR (800-100.000 nm) (Figura 1).
Tabla 1.
Longitud de onda aproximada | Color de la luz que se absorbe | Color de la luz que se refleja |
390-435 | Violeta | Amarillo verdoso |
435-490 | Azul | Amarillo |
490-580 | Verde | Rojo |
580-595 | Amarillo | Azul |
595-650 | Naranjo | Azul verdoso |
650-780 | Rojo | Verde azuloso |
Figura 1.
RELACIÓN ENTRE LA ABSORBANCIA Y LA CONCENTRACIÓN
 Concentración |
El color visible de una solución depende de la luz que transmite, no de la que absorbe. Por ejemplo, una solución roja absorbe luz verde y transmite luz roja, por lo que deberá leerse de 490 a 580 nm.
DIFERENTES MÉTODOS DE ESPECTROMETRÍA
La absorción por parte de las moléculas biológicas de la REM depende de la estructura electrónica de los átomos de carbono que las componen. Esta absorción se rige por la ley de Lambert-Beer, que relaciona la intensidad de la luz incidente (lo) y la de la luz transmitida (I), cuando un rayo de luz atraviesa la longitud (I) de un medio que absorbe luz. Parte del haz de luz será absorbida por las moléculas del medio y el resto se transmitirá a través de él.
1. Transmitancia luminosa (T)
Cuando ocurre el fenómeno descrito anteriormente, queda claro que la intensidad de la luz transmitida ha de ser inferior a la luz incidente, y la Transmitancia será la relación entre la cantidad de luz transmitida a través de la muestra (I) con respecto a la cantidad de luz que choca contra la muestra (lo):
Transmitancia = T = I / lo
Normalmente se expresa de manera porcentual A medida que aumenta la concentración de la sustancia, ésta absorbe más luz y transmite menos, a pesar de lo cual esta relación no es lineal, aunque asume una relación logarítmica inversa.
2. Absorbancia luminosa (A)
La absorbancia es la medida de luz que absorben las moléculas de la muestra. Se emplea para evitar la utilización de unidades logarítmicas. Se define como el logaritmo de 1/T, de lo que podemos obtener:
Esta relación sí es lineal, y es expresada mediante la ley de Lambert y Beer, anteriormente mencionada (ver Figura 1).
Esta gráfica se denomina curva estándar o gráfica de la ley de Lambert y Beer y se emplea para encontrar la concentración de un compuesto a partir del valor de absorbancia detectado.
Cuando esta operación se realiza con una sustancia determinada se obtiene la curva de absorbancia espectral. Cada sustancia posee un espectro característico que se obtiene manualmente realizando diferentes gráficas a concentraciones determinadas contra longitudes de onda o utilizando un transductor. Con ello se determina a qué longitudes de onda la sustancia tiene absorbancia máxima y mínima; así se consigue averiguar cuál es el espectro adecuado para cada sustancia.
3. Los espectrómetros
Los espectrómetros o espectrofotómetros son los instrumentos que se utilizan para medir las REM. Está compuesto por una fuente de luz, un sistema de elección de longitud de onda, un dispositivo para la cubeta de espécimen, un detector de luz y un dispositivo de lectura de la señal generada por el detector (Figura 2). Los espectrómetros son conocidos también con el nombre de espectroscopios o espectrofotómetros, y se utilizan para identificar materiales. El espectroscopio fue inventado por Gustav Robert Georg Kirchhoff y Robert Wilhelm Bunsen. Se usan en astronomía y en algunas ramas de la química. Los primeros espectroscopios eran un simple prisma con graduaciones que marcaban las distintas longitudes de onda de la luz. Los espectroscopios modernos suelen utilizar una rejilla de difracción, ranuras móviles, y algún tipo de fotodetector, todo ello automatizado y controlado por un ordenador.
COMPONENTES BÁSICOS DE UN ESPECTRÓMETRO
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Los tipos de espectrofotómetros que existen actualmente son:
■ Espectrómetro de haz único. Consiste en un solo haz de luz y sus componentes asociados: monocromador, probeta, dispositivo para detener la celda, rendija de salida de luz, detector y dispositivo de lectura, como se ve en la Figura 2, comentada anteriormente.
■ Espectrómetro de doble haz. Posee los mismos componentes, pero además tiene un haz de referencia y uno de muestra, para corregir las variaciones de intensidad de la fuente luminosa. Son más útiles cuando se requieren análisis espectrales, puesto que restan automáticamente la transmitancia luminosa a través de la solución de referencia a distintas longitudes de onda.
■ Espectrómetro de absorción atómica. Este aparato se emplea como método de referencia para el análisis de iones, siendo los de calcio y magnesio los más frecuentemente medidos. Este procedimiento se basa en la absorción de radiación magnética por los átomos no excitados en una llama. La radiación electromagnética consiste en una longitud de onda muy específica que se produce a partir de una lámpara de cátodo hueco (constituida por el mismo metal que se analiza). Este método es muy similar a la espectrofotometría de llama (que se verá a continuación), porque los gases reductores de las llamas transforman los iones metálicos en átomos neutros.
■ Fotómetro de emisión de llama. Este procedimiento se utiliza para la determinación de iones sodio, potasio y litio en líquidos biológicos. En esta técnica se mide la radiación electromagnética que emite una pequeña fracción de los átomos excitados de la muestra (el metal) en la llama. Cuando el dispositivo aspira una solución salina en la ñama, los iones sodio y cloro experimentan dos reacciones (Figura 3). La llama posee dos funciones: con la primera, los gases reductores transforman los iones metálicos en átomos neutros y con la segunda proporciona la energía térmica necesaria para la transición de los electrones en el estado basal a estados excitados (paso a órbitas más externas), ya que un electrón excitado es inestable y tiende a regresar lo más pronto posible a su estado basal, generando energía que se absorbe en forma de luz con una longitud de onda específica.
■ Fluorímetro. Al suministrar energía (en forma de fotones) a una molécula, uno de sus electrones la absorbe y se excita por encima del nivel vibracional más alto. Este electrón pierde con rapidez este exceso de energía al colisionar con otras moléculas por vibración o rotación, regresando a su estado previo, en un periodo de 10"5 a 10 9 segundos, y emite un fotón de luz; esta emisión de luz se denomina fluorescencia. Se observa fluorescencia en moléculas que tienen dobles enlaces conjugados o cuando los electrones de los dobles enlaces quedan fácilmente accesibles por la presencia de grupos amino, por ejemplo, en la molécula.
Figura 3.
REACCIONES PRODUCIDAS EN FOTOMETRÍA DE EMISIÓN DE LLAMA  |
Como resumen, la fotometría tiene aplicaciones analíticas en muestras biológicas, ya que es, en la actualidad, el procedimiento que permite determinar mayor número de parámetros en las analíticas de rutina. Se detectan cambios estructurales o enzimáticos que conllevan una variación de color asociada al cambio químico o en sustancias que posean cromóforos.
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