ELECTROFORESIS
La electroforesis es una técnica de separación de moléculas mediante la aplicación de un campo eléctrico. En un campo eléctrico, las partículas cargadas se mueven a distintas velocidades, dependiendo de su relación carga/masa. Como casi todas las proteínas tienen carga negativa, su migración va a producirse siempre hacia el ánodo (polo positivo).
Las proteínas van a tener una clasificación en función de sus características electroforéticas. Este procedimiento estará siempre realizado en un medio básico (pH 8.6) porque a mayor pH mayor carga negativa de la proteína, y en acetato de celulosa, que es el medio de elección por ser poco costoso, ser fácilmente adaptable a sistemas automatizados y no requerir sistemas ni aparatos de enfriamiento. Así, se consigue una separación proteínica en cinco bandas o fracciones. La proteína que se desplaza con mayor rapidez es la albúmina, lo que correspondería con el primer pico observado en la banda electroforética. El resto de las proteínas se agrupa en las siguientes cuatro bandas, en las que se hallan proteínas funcionalmente diferentes, pero similares desde el punto de vista de la electroforesis (Tabla 2). La diferente composición de las bandas provoca que, menos en el caso de la albúmina, la información que se extrae de la electroforesis, al menos de la convencional, sea más cualitativa que cuantitativa.
Tabla 2.
FRACCIONES ELECTROFORÉTICAS DE LAS PROTEÍNAS Y SUS CONSTITUYENTES, PORCENTAJE RELATIVO Y CONCENTRACIÓN
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En otros casos, como en la electroforesis de hemoglobina, sí se consigue una información más exacta, aunque este procedimiento, que en rigor es idéntico al que se comenta aquí, ha de ser descrito en el capítulo dedicado a las pruebas hematológicas.
1. Procedimiento
Tras la obtención de la muestra sanguínea por un procedimiento estándar, es necesario obtener suero del paciente, para lo que se procede a la centrifugación de la muestra. En la actualidad todos estos procedimientos se realizan de manera automática: el analizador toma una pequeña cantidad de suero y lo implanta en el gel de acetato de celulosa, suspendido en una solución tamponada con pH 8.6.
Posteriormente, se aplica una corriente eléctrica en el baño en el que se encuentra introducido el papel, produciéndose la migración de las proteínas. Posteriormente el medio se trata de manera que las proteínas puedan ser visualizadas, mediante fijación y revelado. Las fracciones se cuantifican por densitometría, empleando luz fluorescente y un detector de fluorescencia o espectrofotométrico para medir la absorción de luz a medida que se toma el electrofotograma: a mayor condensación mayor luz absorbida.
Se encuentran valores aumentados en las enfermedades inflamatorias, en las enfermedades del colágeno, en procesos de deshidratación, en la diabetes, en la cirrosis, en algunos linfomas, en el mieloma, en el Lupus Eritematoso Sistémico, en algunas enfermedades infecciosas y en la artritis reumatoide.
Se pueden hallar valores disminuidos en las enfermedades hematopoyéticas, en las intoxicaciones con tetracloruro de carbono, en las hemorragias, en la disfunción hepática, en la hipogammaglobulinemia, en el síndrome de mala absorción, en la desnutrición, en los carcinomas (sobre todo en los metastásicos), la nefrosis y también en la toxemia del embarazo.
Tal y como se ha comentado previamente, la electroforesis es posible realizarla empleando como base un papel de características especiales sumergido en una solución tamponada. No obstante, en la actualidad es más usual emplear otros soportes.
■ Acetato de celulosa
Las membranas de este material son químicamente más homogéneas que las de papel, y además, tienen la capacidad de transparentarse al secar, por lo que las sustancias separadas pueden cuantificarse. Además, estas membranas son muy elásticas cuando están húmedas y, por el contrario, frágiles y quebradizas al secarse. Otra ventaja que presentan es que requieren que se implante una cantidad menor de muestra (de 1 a 2µl). Por ello, estas membranas son muy empleadas en la realización del proteinograma de rutina y para la separación de lipoproteínas del suero e isoenzimas de lactato deshidrogenasa (LDH) y creatina quinasa (CK) del suero.
Los geles de agarosa, almidón y poliacrilamida son manipulables, consiguiendo variar su porosidad, y con ello que la separación proteica se produzca, además de por diferencia de carga, por diferencia de tamaño. El gel de agarosa permite electroforesis de alta resolución en periodos de tiempo cortos y, además, es transparente. El almidón debe estar parcialmente hidrolizado y el tamaño de sus poros puede modificarse variando la concentración de almidón. Los geles de policriamida también permiten manipular, en función de la concentración, el tamaño del poro.
■ Enfoque isoeléctrico
Es una variación sobre el procedimiento estándar de la electroforesis, que hace migrar compuestos anfotéricos en un medio con un gradiente estable de pH. Las moléculas se mueven hasta el punto donde su pH es igual a su punto isoeléctrico: a este pH la carga neta de la proteína es 0 y la migración se detiene. El gradiente de pH se obtiene empleando anfolitos. En este procedimiento se emplean geles o membranas indistintamente.
■ Electroforesis capilar
Técnica en la que la electroforesis se realiza utilizando capilares de 75 µm de diámetro interior y 25 cm de longitud. El capilar se conecta a un detector en un extremo y a una fuente de corriente por el otro, a través de reservorios sumergidos en un tampón. Las ventajas de este procedimiento estriban en una mayor disipación del calor, un menor volumen de espécimen necesario y una mayor anchura de la zona de separación. La posibilidad de disminuir el calor permite aplicar voltajes mayores, lo que permite mejorar la separación de las proteínas y acortar el tiempo de realización de la técnica. Puede ser empleada en la práctica totalidad de los fluidos biológicos.
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