CROMATOGRAFÍA:
La cromatografía se emplea en el fraccionamiento de proteínas. Su principio es la aplicación de un criterio de separación a las proteínas que se desplazan a lo largo de una columna (de cristal o de plástico) que contiene una matriz sólida porosa, normalmente en forma de gel. A continuación se bombea una gran cantidad de solvente a través de la columna. Las proteínas se van retrasando de manera diferente según sus interacciones con la matriz, por lo que pueden ser recogidas por separado a medida que son eluidas por el fondo de la columna. Según la matriz escogida (el componente de la misma), las proteínas se pueden separar de acuerdo a su carga, su tamaño o su capacidad de unirse a determinados grupos químicos.
La cromatografía es una técnica de separación extraordinariamente versátil que presenta distintas variantes. En toda separación cromatográfica hay dos fases sea sólida, líquida o gaseosa: una móvil y otra estacionaria, que se mueven una con respecto de la otra manteniendo un contacto íntimo. La muestra se introduce en la fase móvil y los componentes de la muestra se distribuyen entre la fase estacionaria y la móvil. Los componentes de la mezcla a separar invierten un tiempo diferente en recorrer cada una de las fases, con lo que se produce la separación. Si un componente está la mayor parte del tiempo en la fase móvil el producto se mueve rápidamente, mientras que si se encuentra la mayor parte en la fase estacionaria, el producto queda retenido y su salida es mucho más lenta.
La pureza de las fracciones obtenidas se suele comprobar mediante la electroforesis en geles de poliacrilamida.
■ Matriz de la columna
Es la sustancia en la que se empapa el solvente. Esta sustancia está empaquetada dentro de la columna. También se le conoce como lecho.
■ Longitud y volumen de la columna
Longitud del dispositivo de cristal o plástico y volumen total del gel contenido en su interior.
■ Volumen muerto de la columna
Cantidad de solvente que tiene que atravesar la columna para asegurar que se ha reemplazado completamente. Coincide con el volumen de solvente que sale de la columna desde que se aplica la muestra hasta que empieza a salir la primera proteína.
En función de cual sea el criterio de separación que se aplique diferenciamos cuatro tipos de cromatografía en columna. Así, se puede hablar de cromatografía de intercambio iónico, que se realiza sobre matrices que tienen una carga neta, positiva. La carga de la matriz de la columna así como la carga de las proteínas dependerá del pH del solvente y de su fuerza iónica, «pie es proporcional a la concentración de iones. En unas condiciones determinadas serán retenidas en la columna las proteínas que tengan una carga complementaria a la de la matriz del gel siendo eluidas las restantes. Para eluir las proteínas retenidas se pueden variar la carga iónica del solvente o su pH de forma que se alcance el punto isoeléctrico de la proteína de interés o el de la matriz, neutralizando de este modo la fuerza que retiene a las proteínas en la columna.
La cromatografía de filtración en gel se realiza empleando unas matrices ¿armadas por unas esferas porosas. El volumen de los poros es muy elevado y su diámetro, está determinado. Cuando penetran en el lecho de la columna dos proteínas de tamaños tales que una penetra en los poros de las bolas de gel y la otra no, la primera se reparte entre el espacio entre las bolas y el interior de los poros, reduciéndose la concentración en la fase libre entre las bolas. La segunda proteína, por tamaño, sólo puede encontrarse entre las bolas. El flujo de solvente es más elevado entre las bolas que en el interior de los poros de éstas, por lo que el efecto neto es el de acelerar el desplazamiento de las proteínas de mayor peso molecular respecto al de las de menor peso molecular. En esta cromatografía se eluyen primero las proteínas mayores, y en segundo lugar las menores, y tiene una gran influencia en el resultado la longitud de la columna y el volumen de la misma: columnas largas aseguran separaciones de mayor calidad. Empleando patrones de proteínas de peso molecular conocido se puede determinar el peso molecular de proteínas de tamaño desconocido. La cromatografía de afinidad consiste en que las bolas de gel que conforman el lecho de la columna presentan en su superficie un ligando, una molécula ante la que tiene afinidad una o más de las proteínas presentes en la mezcla a separar. Al atravesar la columna el ligando secuestra sobre la superficie de las bolas de gel la proteína que le es afín, y deja pasar el resto. La elución de la proteína afín se puede conseguir modificando las propiedades de carga del ligando, variando el pH hasta alcanzar su punto isoeléctrico o la fuerza iónica del solvente, con lo que se reduce la intensidad de la interacción hasta anularla. La naturaleza del ligando es muy variada, puede ser un receptor (proteína) unido a las bolas, que seleccionará sus ligando/s de una mezcla compleja, o el antígeno empleado en una inmunización el que recubre las bolas y que retendrá del suero del animal aquellos anticuerpos que lo reconocen (anticuerpos purificados por afinidad), o en el caso concreto de la inmunoafinidad el ligando que recubre las bolas son anticuerpos que retienen en la columna a aquellas proteínas que contienen los epítopos que reconocen. Por último, la cromatografía líquida de alta resolución (más conocida por sus siglas en inglés HPLC) es la técnica de separación de sustancias más ampliamente utilizada debido a su sensibilidad, su fácil adaptación a las determinaciones cuantitativas exactas, su idoneidad para la separación de especies no volátiles o termolábiles, y sobre todo, su gran aplicabilidad a sustancias que son de primordial interés en la industria, en muchos campos de la ingeniería y para la sociedad en general, como por ejemplo proteínas, oligosacáridos, triglicéridos, vitaminas, fármacos y muestras medioambientales, incluyendo la más común de las determinaciones con este método que es la hemoglobina Ale o glicosilada, utilísima en el seguimiento del paciente diabético.
La técnica se complementa con una serie de detectores cuya aplicabilidad se centra en distintas familias de compuestos (detector diferencial de índice de refracción y detector de fluorescencia), además se incorporan detectores de carácter universal, como son el UV-VIS de fila de fotodiodos y el de más reciente desarrollo: el detector de espectrometría de masas.
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