ELECTROFORESIS

ELECTROFORESIS

La electroforesis es una técnica de separación de moléculas mediante la aplicación de un campo eléctrico. En un campo eléctrico, las partículas cargadas se mueven a distintas velocidades, dependiendo de su relación carga/masa. Como casi todas las proteínas tienen carga negativa, su migración va a producirse siempre hacia el ánodo (polo positivo).

Las proteínas van a tener una clasificación en función de sus características electroforéticas. Este procedimiento estará siempre realizado en un medio básico (pH 8.6) porque a mayor pH mayor carga negativa de la proteína, y en acetato de celulosa, que es el medio de elección por ser poco costoso, ser fácilmente adaptable a sistemas automatizados y no requerir sistemas ni aparatos de enfriamiento. Así, se consigue una separación proteínica en cinco bandas o fracciones. La proteína que se desplaza con mayor rapidez es la albúmina, lo que correspondería con el primer pico observado en la banda electroforética. El resto de las proteínas se agrupa en las siguientes cuatro bandas, en las que se hallan proteínas funcionalmente diferentes, pero similares desde el punto de vista de la electroforesis (Tabla 2). La diferente composición de las bandas provoca que, menos en el caso de la albúmina, la información que se extrae de la electroforesis, al menos de la convencional, sea más cualitativa que cuantitativa.

Tabla 2.

FRACCIONES ELECTROFORÉTICAS DE LAS PROTEÍNAS Y SUS CONSTITUYENTES, PORCENTAJE RELATIVO Y CONCENTRACIÓN Fracción protéica Porcentaje relativo Concentración (g/100ml) Albúmina 52-68% 3.4-5.0 Alfa- 1 (Transcortina, Lipoproteína...) 2.4-4.4% 0.2-0.4 Alfa-2 (Haptoglobina, Ceruloplasmina) 6.1-10.1 % 0.5-0.9 Beta (Transferrina, Hemopexina...) 8.5-14.5 % 0.6-1.1 Gamma (Inmunoglobulinas, PCR) 10-21 % 0.8-1.5

En otros casos, como en la electroforesis de hemoglobina, sí se consigue una información más exacta, aunque este procedimiento, que en rigor es idéntico al que se comenta aquí, ha de ser descrito en el capítulo dedicado a las pruebas hematológicas.

1.        Procedimiento

Tras la obtención de la muestra sanguínea por un procedimiento estándar, es necesario obtener suero del paciente, para lo que se procede a la centrifugación de la muestra. En la actualidad todos estos procedimientos se realizan de manera automática: el analizador toma una pequeña cantidad de suero y lo implanta en el gel de acetato de celulosa, suspendido en una solución tamponada con pH 8.6.

Posteriormente, se aplica una corriente eléctrica en el baño en el que se encuentra introducido el papel, produciéndose la migración de las proteínas. Posteriormente el medio se trata de manera que las proteínas puedan ser visualizadas, mediante fijación y revelado. Las fracciones se cuantifican por densitometría, empleando luz fluorescente y un detector de fluorescencia o espectrofotométrico para medir la absorción de luz a medida que se toma el electrofotograma: a mayor condensación mayor luz absorbida.

Se encuentran valores aumentados en las enfermedades inflamatorias, en las enfermedades del colágeno, en procesos de deshidratación, en la diabetes, en la cirrosis, en algunos linfomas, en el mieloma, en el Lupus Eritematoso Sistémico, en algunas enfermedades infecciosas y en la artritis reumatoide.

Se pueden hallar valores disminuidos en las enfermedades hematopoyéticas, en las intoxicaciones con tetracloruro de carbono, en las hemorragias, en la disfunción hepática, en la hipogammaglobulinemia, en el síndrome de mala absorción, en la desnutrición, en los carcinomas (sobre todo en los metastásicos), la nefrosis y también en la toxemia del embarazo.

2.        Electroforesis. Otros soportes y procedimientos

Tal y como se ha comentado previamente, la electroforesis es posible realizarla empleando como base un papel de características especiales sumergido en una solución tamponada. No obstante, en la actualidad es más usual emplear otros soportes.

■     Acetato de celulosa

Las membranas de este material son químicamente más homogéneas que las de papel, y además, tienen la capacidad de transparentarse al secar, por lo que las sustancias separadas pueden cuantificarse. Ade­más, estas membranas son muy elásticas cuando están húmedas y, por el contrario, frágiles y quebradizas al secarse. Otra ventaja que presentan es que requieren que se implante una cantidad menor de muestra (de 1 a 2µl). Por ello, estas membranas son muy empleadas en la realización del proteinograma de rutina y para la separación de lipoproteínas del suero e isoenzimas de lactato deshidrogenasa (LDH) y creatina quinasa (CK) del suero.

■     Gel

Los geles de agarosa, almidón y poliacrilamida son manipulables, con­siguiendo variar su porosidad, y con ello que la separación proteica se produzca, además de por diferencia de carga, por diferencia de tamaño. El gel de agarosa permite electroforesis de alta resolución en periodos de tiempo cortos y, además, es transparente. El almidón debe estar parcialmente hidrolizado y el tamaño de sus poros puede modificarse variando la concentración de almidón. Los geles de policriamida también permiten manipular, en función de la concen­tración, el tamaño del poro.

■    Enfoque isoeléctrico

Es una variación sobre el procedimiento estándar de la electroforesis, que hace migrar compuestos anfotéricos en un medio con un gradiente estable de pH. Las moléculas se mueven hasta el punto donde su pH es igual a su punto isoeléctrico: a este pH la carga neta de la proteína es 0 y la migración se detiene. El gradiente de pH se obtiene em­pleando anfolitos. En este procedimiento se emplean geles o mem­branas indistintamente.

■     Electroforesis capilar

Técnica en la que la electroforesis se realiza utilizando capilares de 75 µm de diámetro interior y 25 cm de longitud. El capilar se conecta a un detector en un extremo y a una fuente de corriente por el otro, a través de reservorios sumergidos en un tampón. Las ventajas de este procedi­miento estriban en una mayor disipación del calor, un menor volumen de espécimen necesario y una mayor anchura de la zona de separación. La posibilidad de disminuir el calor permite aplicar voltajes mayores, lo que permite mejorar la separación de las proteínas y acortar el tiem­po de realización de la técnica. Puede ser empleada en la práctica tota­lidad de los fluidos biológicos.

CROMATOGRAFÍA

CROMATOGRAFÍA:

La cromatografía se emplea en el fraccionamiento de proteínas. Su principio es la aplicación de un criterio de separación a las proteínas que se desplazan a lo largo de una columna (de cristal o de plástico) que contiene una matriz sólida porosa, normalmente en forma de gel. A continuación se bombea una gran cantidad de solvente a través de la columna. Las proteínas se van retrasando de manera diferente según sus interacciones con la matriz, por lo que pueden ser recogidas por separado a medida que son eluidas por el fondo de la columna. Según la matriz escogida (el componente de la misma), las proteínas se pueden separar de acuerdo a su carga, su tamaño o su capacidad de unirse a determinados grupos químicos.

La cromatografía es una técnica de separación extraordinariamente versátil que presenta distintas variantes. En toda separación cromatográfica hay dos fases sea sólida, líquida o gaseosa: una móvil y otra estacionaria, que se mueven una con respecto de la otra manteniendo un contacto íntimo. La muestra se introduce en la fase móvil y los componentes de la muestra se distribuyen entre la fase estacionaria y la móvil. Los componentes de la mezcla a separar invierten un tiempo diferente en recorrer cada una de las fases, con lo que se produce la separación. Si un componente está la mayor parte del tiempo en la fase móvil el producto se mueve rápidamente, mientras que si se encuentra la mayor parte en la fase estacionaria, el producto queda retenido y su salida es mucho más lenta.

La pureza de las fracciones obtenidas se suele comprobar mediante la electroforesis en geles de poliacrilamida.

1.        Componentes

■                    Matriz de la columna

Es la sustancia en la que se empapa el solvente. Esta sustancia está empaquetada dentro de la columna. También se le conoce como lecho.

■                    Longitud y volumen de la columna

Longitud del dispositivo de cristal o plástico y volumen total del gel contenido en su interior.

■                    Volumen muerto de la columna

Cantidad de solvente que tiene que atravesar la columna para asegurar que se ha reemplazado completamente. Coincide con el volumen de solvente que sale de la columna desde que se aplica la muestra hasta que empieza a salir la primera proteína.

2.        Tipos de Cromatografía

En función de cual sea el criterio de separación que se aplique diferenciamos cuatro tipos de cromatografía en columna. Así, se puede hablar de cromatografía de intercambio iónico, que se realiza sobre matrices que tienen una carga neta, positiva. La carga de la matriz de la columna así como la carga de las proteínas dependerá del pH del solvente y de su fuerza iónica, «pie es proporcional a la concentración de iones. En unas condiciones determinadas serán retenidas en la columna las proteínas que tengan una carga complementaria a la de la matriz del gel siendo eluidas las restantes. Para eluir las proteínas retenidas se pueden variar la carga iónica del solvente o su pH de forma que se alcance el punto isoeléctrico de la proteína de interés o el de la matriz, neutralizando de este modo la fuerza que retiene a las proteínas en la columna.

La cromatografía de filtración en gel se realiza empleando unas matrices ¿armadas por unas esferas porosas. El volumen de los poros es muy elevado y su diámetro, está determinado. Cuando penetran en el lecho de la columna dos proteínas de tamaños tales que una penetra en los poros de las bolas de gel y la otra no, la primera se reparte entre el espacio entre las bolas y el interior de los poros, reduciéndose la concentración en la fase libre entre las bolas. La segunda proteína, por tamaño, sólo puede encontrarse entre las bolas. El flujo de solvente es más elevado entre las bolas que en el interior de los poros de éstas, por lo que el efecto neto es el de acelerar el desplazamiento de las proteínas de mayor peso molecular respecto al de las de menor peso molecular. En esta cromatografía se eluyen primero las proteínas mayores, y en segundo lugar las menores, y tiene una gran influencia en el resultado la longitud de la columna y el volumen de la misma: columnas largas aseguran separaciones de mayor calidad. Empleando patrones de proteínas de peso molecular conocido se puede determinar el peso molecular de proteínas de tamaño desconocido. La cromatografía de afinidad consiste en que las bolas de gel que conforman el lecho de la columna presentan en su superficie un ligando, una molécula ante la que tiene afinidad una o más de las proteínas presentes en la mezcla a separar. Al atravesar la columna el ligando secuestra sobre la superficie de las bolas de gel la proteína que le es afín, y deja pasar el resto. La elución de la proteína afín se puede conseguir modificando las propiedades de carga del ligando, variando el pH hasta alcanzar su punto isoeléctrico o la fuerza iónica del solvente, con lo que se reduce la intensidad de la interacción hasta anularla. La naturaleza del ligando es muy variada, puede ser un receptor (proteína) unido a las bolas, que seleccionará sus ligando/s de una mezcla compleja, o el antígeno empleado en una inmunización el que recubre las bolas y que retendrá del suero del animal aquellos anticuerpos que lo reconocen (anticuerpos purificados por afinidad), o en el caso concreto de la inmunoafinidad el ligando que recubre las bolas son anticuerpos que retienen en la columna a aquellas proteínas que contienen los epítopos que reconocen. Por último, la cromatografía líquida de alta resolución (más conocida por sus siglas en inglés HPLC) es la técnica de separación de sustancias más ampliamente utilizada debido a su sensibilidad, su fácil adaptación a las determinaciones cuantitativas exactas, su idoneidad para la separación de especies no volátiles o termolábiles, y sobre todo, su gran aplicabilidad a sustancias que son de primordial interés en la industria, en muchos campos de la ingeniería y para la sociedad en general, como por ejemplo proteínas, oligosacáridos, triglicéridos, vitaminas, fármacos y muestras medioambientales, incluyendo la más común de las determinaciones con este método que es la hemoglobina Ale o glicosilada, utilísima en el seguimiento del paciente diabético.

La técnica se complementa con una serie de detectores cuya aplicabilidad se centra en distintas familias de compuestos (detector diferencial de índice de refracción y detector de fluorescencia), además se incorporan detectores de carácter universal, como son el UV-VIS de fila de fotodiodos y el de más reciente desarrollo: el detector de espectrometría de masas.

OSMOMETRÍA

OSMOMETRÍA

La osmometría se basa en una de las propiedades coligativas, la osmosis. Existen una serie de membranas semipermeables que únicamente permiten el paso de determinadas especies químicas (moléculas o iones) a través de ellas. Se emplea un dispositivo en el que se separan dos disoluciones mediante una membrana semipermeable; las disoluciones tendrán diferente concentración en un soluto que no sea capaz de atravesar la membrana. La tendencia natural es que se igualen las concentraciones de ambas soluciones; como el soluto no es capaz de atravesar la membrana se produce un flujo de disolvente hacia la disolución más concentrada. En este momento empiezan a equilibrarse dos fuerzas: por un lado la que hace que pase disolvente hacia la disolución más concentrada y por otro la presión hidrostática que aumenta al subir la altura de la columna de disolución. Al final se llega a un equilibrio en el que se percibe una diferencia de alturas entre ambas disoluciones. Esta diferencia de alturas permite calcular la presión hidrostática creada, denominada presión osmótica. Como todas las propiedades coligativas, la presión osmótica depende de la concentración de especies, no de la concentración de moléculas; este aspecto es de capital importancia en la selección de parámetros a medir utilizando este procedimiento, y a la hora de interpretar los resultados suministrados (Figura 4).

Experimentalmente se utilizan un tipo de osmómetros que no utilizan membranas semipermeables y que también se denominan osmómetros de presión de vapor. Estos aparatos constan de dos puntos en los que se ponen las dos disoluciones de diferente concentración (habitualmente una es el disolvente puro), estando las dos a la misma temperatura. Debido a la diferencia de concentraciones, se evapora parte del disolvente de la disolución más diluida que se deposita en la disolución más concentrada. Esto produce una diferencia de temperatura entre ambas disoluciones que el aparato es capaz de registrar. A partir de dichas diferencias de temperatura y con ayuda de una curva de calibrado previa, es posible establecer la diferencia de concentraciones y por lo tanto, la masa molar de la sustancia.

Figura 4.

ESQUEMA DEL FUNCIONAMIENTO OSMÓTICO

Espectrometría

Espectrometría:

Estas técnicas están basadas en la interacción de las radiaciones electromagnéticas en la materia. Se utilizan los patrones característicos de la absorbancia de radiación electromagnética (REM o patrones espectrales) para identificar los analitos de interés, ya que el comportamiento de estas sustancias biológicas con respecto a las REM depende del número de átomos de carbono que poseen.

La espectrofotometría se basa en mediciones con detectores de la REM que se transmite; por ello es necesario apuntar las características básicas de este tipo de radiación.

1.        La luz

La luz es una forma visible de REM, se comporta como si tuviera campos magnéticos y eléctricos oscilando en planos perpendiculares entre sí. Está formada por paquetes de energía denominados fotones. En espectroscopia el término luz define la forma visible de la REM junto con la ultravioleta y la infrarroja.

2.        Longitud de onda

La longitud de onda del espectro electromagnético es la distancia entre los máximos de ondas sucesivas. En el sistema internacional (SI) se mide en nanómetros (nm, 10"⁹ m). Otros términos empleados son número de onda, que es el recíproco a la longitud de onda, y la frecuencia, que es el número de ondas por segundo. La longitud de onda es inversamente proporcional a la energía: mientras mayor es la longitud de onda, menor es el número de fotones que contiene.

3.        Espectro electromagnético (EEM)

La REM está compuesta por varios tipos de radiación: rayos gamma, rayos X, rayos ultravioleta (UV), radiación visible (RV), radiación infrarroja (IR), microondas y ondas de radio (Tabla 1). En espectrofotometría de absorbancia se emplean las regiones UV (195-380 nm), RV (390-780 nm) e IR (800-100.000 nm) (Figura 1).

Tabla 1.

CARACTERÍSTICAS DEL ESPECTRO VISIBLE

Longitud de onda aproximada	Color de la luz que se absorbe	Color de la luz que se refleja
390-435	Violeta	Amarillo verdoso
435-490	Azul	Amarillo
490-580	Verde	Rojo
580-595	Amarillo	Azul
595-650	Naranjo	Azul verdoso
650-780	Rojo	Verde azuloso

Figura 1.

RELACIÓN ENTRE LA ABSORBANCIA Y LA CONCENTRACIÓN

Concentración

El color visible de una solución depende de la luz que transmite, no de la que absorbe. Por ejemplo, una solución roja absorbe luz verde y transmite luz roja, por lo que deberá leerse de 490 a 580 nm.

 DIFERENTES MÉTODOS DE ESPECTROMETRÍA

La absorción por parte de las moléculas biológicas de la REM depende de la estructura electrónica de los átomos de carbono que las componen. Esta absorción se rige por la ley de Lambert-Beer, que relaciona la intensidad de la luz incidente (lo) y la de la luz transmitida (I), cuando un rayo de luz atraviesa la longitud (I) de un medio que absorbe luz. Parte del haz de luz será absorbida por las moléculas del medio y el resto se transmitirá a través de él.

1.         Transmitancia luminosa (T)

Cuando ocurre el fenómeno descrito anteriormente, queda claro que la intensidad de la luz transmitida ha de ser inferior a la luz incidente, y la Transmitancia será la relación entre la cantidad de luz transmitida a través de la muestra (I) con respecto a la cantidad de luz que choca contra la muestra (lo):

Transmitancia = T = I / lo

Normalmente se expresa de manera porcentual A medida que aumenta la concentración de la sustancia, ésta absorbe más luz y transmite menos, a pesar de lo cual esta relación no es lineal, aunque asume una relación logarítmica inversa.

2.         Absorbancia luminosa (A)

La absorbancia es la medida de luz que absorben las moléculas de la muestra. Se emplea para evitar la utilización de unidades logarítmicas. Se define como el logaritmo de 1/T, de lo que podemos obtener:

Esta relación sí es lineal, y es expresada mediante la ley de Lambert y Beer, anteriormente mencionada (ver Figura 1).

Esta gráfica se denomina curva estándar o gráfica de la ley de Lambert y Beer y se emplea para encontrar la concentración de un compuesto a partir del valor de absorbancia detectado.

Cuando esta operación se realiza con una sustancia determinada se obtiene la curva de absorbancia espectral. Cada sustancia posee un espectro característico que se obtiene manualmente realizando diferentes gráficas a concentraciones determinadas contra longitudes de onda o utilizando un transductor. Con ello se determina a qué longitudes de onda la sustancia tiene absorbancia máxima y mínima; así se consigue averiguar cuál es el espectro adecuado para cada sustancia.

3.         Los espectrómetros

Los espectrómetros o espectrofotómetros son los instrumentos que se utilizan para medir las REM. Está compuesto por una fuente de luz, un sistema de elección de longitud de onda, un dispositivo para la cubeta de espécimen, un detector de luz y un dispositivo de lectura de la señal generada por el detector (Figura 2). Los espectrómetros son conocidos también con el nombre de espectroscopios o espectrofotómetros, y se utilizan para identificar materiales. El espectroscopio fue inventado por Gustav Robert Georg Kirchhoff y Robert Wilhelm Bunsen. Se usan en astronomía y en algunas ramas de la química. Los primeros espectroscopios eran un simple prisma con graduaciones que marcaban las distintas longitudes de onda de la luz. Los espectroscopios modernos suelen utilizar una rejilla de difracción, ranuras móviles, y algún tipo de fotodetector, todo ello automatizado y controlado por un ordenador.

COMPONENTES BÁSICOS DE UN ESPECTRÓMETRO

Los tipos de espectrofotómetros que existen actualmente son:

■     Espectrómetro de haz único. Consiste en un solo haz de luz y sus componentes asociados: monocromador, probeta, dispositivo para de­tener la celda, rendija de salida de luz, detector y dispositivo de lectu­ra, como se ve en la Figura 2, comentada anteriormente.

■     Espectrómetro de doble haz. Posee los mismos componentes, pero además tiene un haz de referencia y uno de muestra, para corregir las variaciones de intensidad de la fuente luminosa. Son más útiles cuan­do se requieren análisis espectrales,  puesto que restan automáticamente la transmitancia luminosa a través de la solución de referencia a distin­tas longitudes de onda.

■     Espectrómetro de absorción atómica. Este aparato se emplea como método de referencia para el análisis de iones, siendo los de calcio y magnesio los más frecuentemente medidos. Este procedimiento se basa en la absorción de radiación magnética por los átomos no excitados en una llama. La radiación electromagnética consiste en una longitud de onda muy específica que se produce a partir de una lámpara de cátodo hueco (constituida por el mismo metal que se analiza). Este método es muy similar a la espectrofotometría de llama (que se verá a continua­ción), porque los gases reductores de las llamas transforman los iones metálicos en átomos neutros.

■    Fotómetro de emisión de llama. Este procedimiento se utiliza para la determinación de iones sodio, potasio y litio en líquidos biológicos. En esta técnica se mide la radiación electromagnética que emite una pe­queña fracción de los átomos excitados de la muestra (el metal) en la llama. Cuando el dispositivo aspira una solución salina en la ñama, los iones sodio y cloro experimentan dos reacciones (Figura 3). La llama posee dos funciones: con la primera, los gases reductores transforman los iones metálicos en átomos neutros y con la segunda proporciona la energía térmica necesaria para la transición de los electrones en el es­tado basal a estados excitados (paso a órbitas más externas), ya que un electrón excitado es inestable y tiende a regresar lo más pronto posible a su estado basal, generando energía que se absorbe en forma de luz con una longitud de onda específica.

■ Fluorímetro. Al suministrar energía (en forma de fotones) a una molé­cula, uno de sus electrones la absorbe y se excita por encima del nivel vibracional más alto. Este electrón pierde con rapidez este exceso de energía al colisionar con otras moléculas por vibración o rotación, regre­sando a su estado previo, en un periodo de 10"⁵ a 10 ⁹ segundos, y emite un fotón de luz; esta emisión de luz se denomina fluorescencia. Se ob­serva fluorescencia en moléculas que tienen dobles enlaces conjugados o cuando los electrones de los dobles enlaces quedan fácilmente accesi­bles por la presencia de grupos amino, por ejemplo, en la molécula.

Figura 3.

REACCIONES PRODUCIDAS EN FOTOMETRÍA DE EMISIÓN DE LLAMA

Como resumen, la fotometría tiene aplicaciones analíticas en muestras biológicas, ya que es, en la actualidad, el procedimiento que permite determinar mayor número de parámetros en las analíticas de rutina. Se detectan cambios estructurales o enzimáticos que conllevan una variación de color asociada al cambio químico o en sustancias que posean cromóforos.