CROMATOGRAFÍA

CROMATOGRAFÍA:

La cromatografía se emplea en el fraccionamiento de proteínas. Su principio es la aplicación de un criterio de separación a las proteínas que se desplazan a lo largo de una columna (de cristal o de plástico) que contiene una matriz sólida porosa, normalmente en forma de gel. A continuación se bombea una gran cantidad de solvente a través de la columna. Las proteínas se van retrasando de manera diferente según sus interacciones con la matriz, por lo que pueden ser recogidas por separado a medida que son eluidas por el fondo de la columna. Según la matriz escogida (el componente de la misma), las proteínas se pueden separar de acuerdo a su carga, su tamaño o su capacidad de unirse a determinados grupos químicos.

La cromatografía es una técnica de separación extraordinariamente versátil que presenta distintas variantes. En toda separación cromatográfica hay dos fases sea sólida, líquida o gaseosa: una móvil y otra estacionaria, que se mueven una con respecto de la otra manteniendo un contacto íntimo. La muestra se introduce en la fase móvil y los componentes de la muestra se distribuyen entre la fase estacionaria y la móvil. Los componentes de la mezcla a separar invierten un tiempo diferente en recorrer cada una de las fases, con lo que se produce la separación. Si un componente está la mayor parte del tiempo en la fase móvil el producto se mueve rápidamente, mientras que si se encuentra la mayor parte en la fase estacionaria, el producto queda retenido y su salida es mucho más lenta.

La pureza de las fracciones obtenidas se suele comprobar mediante la electroforesis en geles de poliacrilamida.

1.        Componentes

■                    Matriz de la columna

Es la sustancia en la que se empapa el solvente. Esta sustancia está empaquetada dentro de la columna. También se le conoce como lecho.

■                    Longitud y volumen de la columna

Longitud del dispositivo de cristal o plástico y volumen total del gel contenido en su interior.

■                    Volumen muerto de la columna

Cantidad de solvente que tiene que atravesar la columna para asegurar que se ha reemplazado completamente. Coincide con el volumen de solvente que sale de la columna desde que se aplica la muestra hasta que empieza a salir la primera proteína.

2.        Tipos de Cromatografía

En función de cual sea el criterio de separación que se aplique diferenciamos cuatro tipos de cromatografía en columna. Así, se puede hablar de cromatografía de intercambio iónico, que se realiza sobre matrices que tienen una carga neta, positiva. La carga de la matriz de la columna así como la carga de las proteínas dependerá del pH del solvente y de su fuerza iónica, «pie es proporcional a la concentración de iones. En unas condiciones determinadas serán retenidas en la columna las proteínas que tengan una carga complementaria a la de la matriz del gel siendo eluidas las restantes. Para eluir las proteínas retenidas se pueden variar la carga iónica del solvente o su pH de forma que se alcance el punto isoeléctrico de la proteína de interés o el de la matriz, neutralizando de este modo la fuerza que retiene a las proteínas en la columna.

La cromatografía de filtración en gel se realiza empleando unas matrices ¿armadas por unas esferas porosas. El volumen de los poros es muy elevado y su diámetro, está determinado. Cuando penetran en el lecho de la columna dos proteínas de tamaños tales que una penetra en los poros de las bolas de gel y la otra no, la primera se reparte entre el espacio entre las bolas y el interior de los poros, reduciéndose la concentración en la fase libre entre las bolas. La segunda proteína, por tamaño, sólo puede encontrarse entre las bolas. El flujo de solvente es más elevado entre las bolas que en el interior de los poros de éstas, por lo que el efecto neto es el de acelerar el desplazamiento de las proteínas de mayor peso molecular respecto al de las de menor peso molecular. En esta cromatografía se eluyen primero las proteínas mayores, y en segundo lugar las menores, y tiene una gran influencia en el resultado la longitud de la columna y el volumen de la misma: columnas largas aseguran separaciones de mayor calidad. Empleando patrones de proteínas de peso molecular conocido se puede determinar el peso molecular de proteínas de tamaño desconocido. La cromatografía de afinidad consiste en que las bolas de gel que conforman el lecho de la columna presentan en su superficie un ligando, una molécula ante la que tiene afinidad una o más de las proteínas presentes en la mezcla a separar. Al atravesar la columna el ligando secuestra sobre la superficie de las bolas de gel la proteína que le es afín, y deja pasar el resto. La elución de la proteína afín se puede conseguir modificando las propiedades de carga del ligando, variando el pH hasta alcanzar su punto isoeléctrico o la fuerza iónica del solvente, con lo que se reduce la intensidad de la interacción hasta anularla. La naturaleza del ligando es muy variada, puede ser un receptor (proteína) unido a las bolas, que seleccionará sus ligando/s de una mezcla compleja, o el antígeno empleado en una inmunización el que recubre las bolas y que retendrá del suero del animal aquellos anticuerpos que lo reconocen (anticuerpos purificados por afinidad), o en el caso concreto de la inmunoafinidad el ligando que recubre las bolas son anticuerpos que retienen en la columna a aquellas proteínas que contienen los epítopos que reconocen. Por último, la cromatografía líquida de alta resolución (más conocida por sus siglas en inglés HPLC) es la técnica de separación de sustancias más ampliamente utilizada debido a su sensibilidad, su fácil adaptación a las determinaciones cuantitativas exactas, su idoneidad para la separación de especies no volátiles o termolábiles, y sobre todo, su gran aplicabilidad a sustancias que son de primordial interés en la industria, en muchos campos de la ingeniería y para la sociedad en general, como por ejemplo proteínas, oligosacáridos, triglicéridos, vitaminas, fármacos y muestras medioambientales, incluyendo la más común de las determinaciones con este método que es la hemoglobina Ale o glicosilada, utilísima en el seguimiento del paciente diabético.

La técnica se complementa con una serie de detectores cuya aplicabilidad se centra en distintas familias de compuestos (detector diferencial de índice de refracción y detector de fluorescencia), además se incorporan detectores de carácter universal, como son el UV-VIS de fila de fotodiodos y el de más reciente desarrollo: el detector de espectrometría de masas.

OSMOMETRÍA

OSMOMETRÍA

La osmometría se basa en una de las propiedades coligativas, la osmosis. Existen una serie de membranas semipermeables que únicamente permiten el paso de determinadas especies químicas (moléculas o iones) a través de ellas. Se emplea un dispositivo en el que se separan dos disoluciones mediante una membrana semipermeable; las disoluciones tendrán diferente concentración en un soluto que no sea capaz de atravesar la membrana. La tendencia natural es que se igualen las concentraciones de ambas soluciones; como el soluto no es capaz de atravesar la membrana se produce un flujo de disolvente hacia la disolución más concentrada. En este momento empiezan a equilibrarse dos fuerzas: por un lado la que hace que pase disolvente hacia la disolución más concentrada y por otro la presión hidrostática que aumenta al subir la altura de la columna de disolución. Al final se llega a un equilibrio en el que se percibe una diferencia de alturas entre ambas disoluciones. Esta diferencia de alturas permite calcular la presión hidrostática creada, denominada presión osmótica. Como todas las propiedades coligativas, la presión osmótica depende de la concentración de especies, no de la concentración de moléculas; este aspecto es de capital importancia en la selección de parámetros a medir utilizando este procedimiento, y a la hora de interpretar los resultados suministrados (Figura 4).

Experimentalmente se utilizan un tipo de osmómetros que no utilizan membranas semipermeables y que también se denominan osmómetros de presión de vapor. Estos aparatos constan de dos puntos en los que se ponen las dos disoluciones de diferente concentración (habitualmente una es el disolvente puro), estando las dos a la misma temperatura. Debido a la diferencia de concentraciones, se evapora parte del disolvente de la disolución más diluida que se deposita en la disolución más concentrada. Esto produce una diferencia de temperatura entre ambas disoluciones que el aparato es capaz de registrar. A partir de dichas diferencias de temperatura y con ayuda de una curva de calibrado previa, es posible establecer la diferencia de concentraciones y por lo tanto, la masa molar de la sustancia.

Figura 4.

ESQUEMA DEL FUNCIONAMIENTO OSMÓTICO

Espectrometría

Espectrometría:

Estas técnicas están basadas en la interacción de las radiaciones electromagnéticas en la materia. Se utilizan los patrones característicos de la absorbancia de radiación electromagnética (REM o patrones espectrales) para identificar los analitos de interés, ya que el comportamiento de estas sustancias biológicas con respecto a las REM depende del número de átomos de carbono que poseen.

La espectrofotometría se basa en mediciones con detectores de la REM que se transmite; por ello es necesario apuntar las características básicas de este tipo de radiación.

1.        La luz

La luz es una forma visible de REM, se comporta como si tuviera campos magnéticos y eléctricos oscilando en planos perpendiculares entre sí. Está formada por paquetes de energía denominados fotones. En espectroscopia el término luz define la forma visible de la REM junto con la ultravioleta y la infrarroja.

2.        Longitud de onda

La longitud de onda del espectro electromagnético es la distancia entre los máximos de ondas sucesivas. En el sistema internacional (SI) se mide en nanómetros (nm, 10"⁹ m). Otros términos empleados son número de onda, que es el recíproco a la longitud de onda, y la frecuencia, que es el número de ondas por segundo. La longitud de onda es inversamente proporcional a la energía: mientras mayor es la longitud de onda, menor es el número de fotones que contiene.

3.        Espectro electromagnético (EEM)

La REM está compuesta por varios tipos de radiación: rayos gamma, rayos X, rayos ultravioleta (UV), radiación visible (RV), radiación infrarroja (IR), microondas y ondas de radio (Tabla 1). En espectrofotometría de absorbancia se emplean las regiones UV (195-380 nm), RV (390-780 nm) e IR (800-100.000 nm) (Figura 1).

Tabla 1.

CARACTERÍSTICAS DEL ESPECTRO VISIBLE

Longitud de onda aproximada	Color de la luz que se absorbe	Color de la luz que se refleja
390-435	Violeta	Amarillo verdoso
435-490	Azul	Amarillo
490-580	Verde	Rojo
580-595	Amarillo	Azul
595-650	Naranjo	Azul verdoso
650-780	Rojo	Verde azuloso

Figura 1.

RELACIÓN ENTRE LA ABSORBANCIA Y LA CONCENTRACIÓN

Concentración

El color visible de una solución depende de la luz que transmite, no de la que absorbe. Por ejemplo, una solución roja absorbe luz verde y transmite luz roja, por lo que deberá leerse de 490 a 580 nm.

 DIFERENTES MÉTODOS DE ESPECTROMETRÍA

La absorción por parte de las moléculas biológicas de la REM depende de la estructura electrónica de los átomos de carbono que las componen. Esta absorción se rige por la ley de Lambert-Beer, que relaciona la intensidad de la luz incidente (lo) y la de la luz transmitida (I), cuando un rayo de luz atraviesa la longitud (I) de un medio que absorbe luz. Parte del haz de luz será absorbida por las moléculas del medio y el resto se transmitirá a través de él.

1.         Transmitancia luminosa (T)

Cuando ocurre el fenómeno descrito anteriormente, queda claro que la intensidad de la luz transmitida ha de ser inferior a la luz incidente, y la Transmitancia será la relación entre la cantidad de luz transmitida a través de la muestra (I) con respecto a la cantidad de luz que choca contra la muestra (lo):

Transmitancia = T = I / lo

Normalmente se expresa de manera porcentual A medida que aumenta la concentración de la sustancia, ésta absorbe más luz y transmite menos, a pesar de lo cual esta relación no es lineal, aunque asume una relación logarítmica inversa.

2.         Absorbancia luminosa (A)

La absorbancia es la medida de luz que absorben las moléculas de la muestra. Se emplea para evitar la utilización de unidades logarítmicas. Se define como el logaritmo de 1/T, de lo que podemos obtener:

Esta relación sí es lineal, y es expresada mediante la ley de Lambert y Beer, anteriormente mencionada (ver Figura 1).

Esta gráfica se denomina curva estándar o gráfica de la ley de Lambert y Beer y se emplea para encontrar la concentración de un compuesto a partir del valor de absorbancia detectado.

Cuando esta operación se realiza con una sustancia determinada se obtiene la curva de absorbancia espectral. Cada sustancia posee un espectro característico que se obtiene manualmente realizando diferentes gráficas a concentraciones determinadas contra longitudes de onda o utilizando un transductor. Con ello se determina a qué longitudes de onda la sustancia tiene absorbancia máxima y mínima; así se consigue averiguar cuál es el espectro adecuado para cada sustancia.

3.         Los espectrómetros

Los espectrómetros o espectrofotómetros son los instrumentos que se utilizan para medir las REM. Está compuesto por una fuente de luz, un sistema de elección de longitud de onda, un dispositivo para la cubeta de espécimen, un detector de luz y un dispositivo de lectura de la señal generada por el detector (Figura 2). Los espectrómetros son conocidos también con el nombre de espectroscopios o espectrofotómetros, y se utilizan para identificar materiales. El espectroscopio fue inventado por Gustav Robert Georg Kirchhoff y Robert Wilhelm Bunsen. Se usan en astronomía y en algunas ramas de la química. Los primeros espectroscopios eran un simple prisma con graduaciones que marcaban las distintas longitudes de onda de la luz. Los espectroscopios modernos suelen utilizar una rejilla de difracción, ranuras móviles, y algún tipo de fotodetector, todo ello automatizado y controlado por un ordenador.

COMPONENTES BÁSICOS DE UN ESPECTRÓMETRO

Los tipos de espectrofotómetros que existen actualmente son:

■     Espectrómetro de haz único. Consiste en un solo haz de luz y sus componentes asociados: monocromador, probeta, dispositivo para de­tener la celda, rendija de salida de luz, detector y dispositivo de lectu­ra, como se ve en la Figura 2, comentada anteriormente.

■     Espectrómetro de doble haz. Posee los mismos componentes, pero además tiene un haz de referencia y uno de muestra, para corregir las variaciones de intensidad de la fuente luminosa. Son más útiles cuan­do se requieren análisis espectrales,  puesto que restan automáticamente la transmitancia luminosa a través de la solución de referencia a distin­tas longitudes de onda.

■     Espectrómetro de absorción atómica. Este aparato se emplea como método de referencia para el análisis de iones, siendo los de calcio y magnesio los más frecuentemente medidos. Este procedimiento se basa en la absorción de radiación magnética por los átomos no excitados en una llama. La radiación electromagnética consiste en una longitud de onda muy específica que se produce a partir de una lámpara de cátodo hueco (constituida por el mismo metal que se analiza). Este método es muy similar a la espectrofotometría de llama (que se verá a continua­ción), porque los gases reductores de las llamas transforman los iones metálicos en átomos neutros.

■    Fotómetro de emisión de llama. Este procedimiento se utiliza para la determinación de iones sodio, potasio y litio en líquidos biológicos. En esta técnica se mide la radiación electromagnética que emite una pe­queña fracción de los átomos excitados de la muestra (el metal) en la llama. Cuando el dispositivo aspira una solución salina en la ñama, los iones sodio y cloro experimentan dos reacciones (Figura 3). La llama posee dos funciones: con la primera, los gases reductores transforman los iones metálicos en átomos neutros y con la segunda proporciona la energía térmica necesaria para la transición de los electrones en el es­tado basal a estados excitados (paso a órbitas más externas), ya que un electrón excitado es inestable y tiende a regresar lo más pronto posible a su estado basal, generando energía que se absorbe en forma de luz con una longitud de onda específica.

■ Fluorímetro. Al suministrar energía (en forma de fotones) a una molé­cula, uno de sus electrones la absorbe y se excita por encima del nivel vibracional más alto. Este electrón pierde con rapidez este exceso de energía al colisionar con otras moléculas por vibración o rotación, regre­sando a su estado previo, en un periodo de 10"⁵ a 10 ⁹ segundos, y emite un fotón de luz; esta emisión de luz se denomina fluorescencia. Se ob­serva fluorescencia en moléculas que tienen dobles enlaces conjugados o cuando los electrones de los dobles enlaces quedan fácilmente accesi­bles por la presencia de grupos amino, por ejemplo, en la molécula.

Figura 3.

REACCIONES PRODUCIDAS EN FOTOMETRÍA DE EMISIÓN DE LLAMA

Como resumen, la fotometría tiene aplicaciones analíticas en muestras biológicas, ya que es, en la actualidad, el procedimiento que permite determinar mayor número de parámetros en las analíticas de rutina. Se detectan cambios estructurales o enzimáticos que conllevan una variación de color asociada al cambio químico o en sustancias que posean cromóforos.

Referencias históricas del Laboratorio de Bioquímica:

Referencias históricas del Laboratorio de Bioquímica:

Desde antiguo, el ser humano siempre ha querido conocer sus orígenes. En este orden de cosas, esta curiosidad congénita ha llevado, a lo largo de los siglos, a cuestionar seriamente los principios inmutables que, en el pasado, fueron considerados como los grandes arcanos de la antigüedad. Desde diversos puntos de vista la religión, la filosofía, la ciencia) el ser humano ha intentado responder a la pregunta primigenia: el origen de la vida. La Química orgánica o Bioquímica, y dentro de ella la Bioquímica Clínica, es la disciplina que más se acerca a proporcionar respuestas fidedignas a estas cuestiones, ya que tanto la genética como la biología molecular, que son sin duda unas de las ventanas más importantes que nos permiten explorar en la actualidad para conocer el origen de la vida, beben directamente de sus fuentes.

La bioquímica clínica estudia los aspectos químicos de la vida humana, en la salud y en la enfermedad y comprende el estudio de los procesos metabólicos en relación con los cambios fisiológicos y patológicos, y aquellos que pudieren ser inducidos por maniobras terapéuticas.

El primer fluido orgánico analizado del que se tienen referencias fue la orina por motivos obvios: por su fácil obtención y por existir la posibilidad de conseguir grandes cantidades sin molestias para el paciente. El color de la orina se empleaba como método diagnóstico en Babilonia, Egipto y la India. Hipócrates, 400 años a.C., señaló la importancia del estudio detallado de la orina (análisis por los sentidos), describiendo el análisis de su consistencia, color y sedimento. Este método hipocrático se mezcló, durante la Edad Media, con aspectos "mágicos", que dieron lugar a la uromancia, que preconizaba la existencia de un tipo determinado de orina para cada enfermedad. Estos "analistas" ni siquiera examinaban a sus pacientes, haciéndose llamar los "profetas del pis". Probar el sabor de la orina fue también la primera prueba diagnóstica de la diabetes.

Fuera de aspectos más relacionados con la alquimia y los métodos herméticos, la primera prueba química diagnóstica fue descrita por Richard Bright en 1827, que demostró la presencia de proteínas en la orina de algunos pacientes con hidropesía. La prueba se realizaba calentando la orina, con lo que las proteínas floculaban. Poco tiempo después se desarrollaron otros métodos y pruebas para detectar los constituyentes de la orina.

La sangre comenzó a ser estudiada a mediados del siglo XIX, y las primeras muestras procedían de las sangrías terapéuticas. No obstante, estas primeras determinaciones requerían gran cantidad de sangre. Como ejemplo, Rees, en el Reino Unido, demostró la presencia de glucosa en la sangre de un diabético a partir de 360mL de muestra. Para ello realizó diversas extracciones y evaporaciones, aislando los cristales de glucosa. No se informó del estado del paciente tras la prueba diagnóstica. De modo similar Garrod aisló cristales de urato sódico de un paciente con gota, en 1848.

Es a finales del siglo XIX cuando empiezan a desarrollarse métodos más o menos rutinarios para fines diagnósticos; así, en los laboratorios de los mejores hospitales de la época era posible determinar la hemoglobina, los recuentos celulares sanguíneos de serie roja y serie blanca, el examen microscópico de frotis (incluyendo recuento de plaquetas) y en la orina, se podían determinar densidad, proteínas, glucosa, hemoglobina, bilirrubina y sedimento.

El gran espaldarazo para el laboratorio de bioquímica clínica se recibe durante los primeros años del siglo XX, con el descubrimiento de los primeros métodos colorimétricos, que permitían utilizar muestras relativamente pequeñas de sangre, y con la extensión del uso de la jeringa hipodérmica para obtener las muestras.

Así, se puede observar como en 1910 Wohlgemuth describe un método para la determinación de la amilasa en sangre y orina y en 1911 Roña y Michaelis hicieron lo propio para determinar la lipasa en sangre. A lo largo de la década de los 30 varios investigadores describieron la presencia de fosfatasa alcalina elevada en el suero de determinado tipo de pacientes (ictericia obstructiva, enfermedades óseas). En 1935 Warburg descubre las enzimas que transfieren hidrógeno y la función de las coenzimas correspondientes, creando la denominada prueba óptica, que se basa en la medición de la absorbancia a 340 nanometros (nm) de longitud de onda de las formas reducidas de las coenzimas NADH y NADHP.

El siguiente salto cualitativo se produce a finales de los años 50, con el inicio de la automatización de los laboratorios. Ello permitió atender a un número de pacientes cada vez mayor, derivado de una mayor demanda por parte de los clínicos, y controlar mejor todos los procesos empleados en el análisis bioquímico, comenzando la estandarización metodológica y de procesos, aumentando por lo tanto la calidad. Estos dos últimos aspectos se desarrollaron definitivamente durante la década siguiente, con la incorporación de los kits de reactivos a los laboratorios, proporcionados por la industria.

En cuanto a los reactivos, hay que señalar dos importantes hitos. El primero, el uso de enzimas como reactivos, lo que causó una simplificación de los análisis en términos técnicos y de manipulación, aumentando la seguridad de los operadores. Una de las primeras enzimas empleadas fue la glucosa-oxidasa. El segundo, el uso de anticuerpos, a partir de los descubrimientos de Yalow y Berson en 1959. Estos dos científicos midieron con un método de radioinmunoanálisis la insulina en suero. A estos métodos que empleaban reactivos radiactivos les siguieron gran número de sustancias menos peligrosas, como enzimas y compuestos fluorescentes, hasta el descubrimiento por Kohler y Mildstein de los anticuerpos monoclonales en 1975.

El devenir de los años ha convertido al antiguo laboratorio, un lugar modesto que apoyaba discretamente al diagnóstico y la evolución de los pacientes, en un centro neurálgico en los hospitales de la actualidad, todo ello aderezado con la pujanza económica que ha obtenido la industria relacionada con ellos.

En la actualidad, el incremento desmedido de las pruebas de laboratorio ha causado la creación de grandes centros de análisis, gestionados por potentes aplicaciones informáticas, altamente robotizados, que tienen por objetivo optimizar y conseguir que tanto los medios como el personal disponible sean más operativos.